PAGE中DTT還原劑的真正作用
發 問 者： 阿臣 ( 初學者 5 級 )
發問時間： 2006-05-05 15:42:31 ／ 解決時間： 2006-05-10 00:59:35
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我找了好多文章,發現這是一些對dithiothreitol(DTT)或beta-mercaptoethanol所講的介紹：
dithiothreitol (DTT): Protective agent for SH groups.
beta-mercaptoethanol: 其SH基可以吸收氧分子，以防止氧化反應破壞蛋白質構形，可以說是犧牲了自己來拯救蛋白質。
可是大家都知道在PAGE實驗中,sample加入還原劑是為了打斷雙硫鍵,使蛋白質變為線性結構，我想要問的是:這些還原劑打斷雙硫鍵的作用是怎麼產生的?若看剛剛那些描述,似乎它只能"被動的防止"氧化,而不能"主動地"還原它人,那為何其仍可打斷雙硫鍵呢?
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回 答 者： dnaling ( 初學者 5 級 )
回答時間： 2006-05-06 18:31:27
DTT (dithiothreitol)與2-ME (beta-mercaptoethanol)都是還原劑 (reducing agent)，可作為打斷雙硫鍵的化學物品，同時也用於穩定蛋白質。這兩者的用途的差別就在於使用時的濃度以及作用趨勢在哪邊。
DTT與2-ME在濃度較低時，可以用來吸收環境中的氧化劑，讓一些enzyme或是具有SH但非雙硫鍵者 (free SH)能維持住，不會因被氧化而失去活性。(也就是您所說的犧牲自己來拯救蛋白質)
當DTT與2-ME作用濃度較高時，通常是要他們作為還原劑來打破雙硫鍵，利用本身SH或OH的氧化去還原雙硫鍵的S-S，所以可以作為denature protein的用途。
所以說DTT與2-ME可以說是雙面刃，使用時要特別注意濃度以及用途，依據你的需求來控制，但是如果你的作用只是denature protein，濃度夠高就會作用啦。一般而言，在相同濃度下，2-ME的還原能力較DTT強，但是毒性也較強，使用時要特別小心。
PS. 2-ME非常臭，最好在化學抽氣櫃中操作。
參考資料
DTT:
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/ProductDetail/FLUKA/43817
2-ME
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/ProductDetail/SIAL/M6250
2006-05-06 18:38 回答補充
我所謂的濃度高低的作用，並不是說在濃度高時就無法吸收環境的氧化劑，只會破壞雙硫鍵；也不是說濃度低時就不會破壞雙硫鍵，只會吸收環境的氧化劑。這些情況同時都還是會發生的，只是相對性較偏向於哪一種作用。
再附註一點，DTT或2-ME用較高濃度來打破雙硫鍵，你可以把他想成：使用高量來把大多數物質還原，環境中的氧化劑以及蛋白質的雙硫鍵都會被還原，所以雙硫鍵會被打斷。
2006-05-08 00:20:01 發問補充
在聽了你的解釋後, 我想是否可以這樣說:
雙硫鍵被打斷之情形如右: -S-S- <---> -SH + -SH, 往右是還原作用, 往左便氧化，若暫不管是否是犧牲自己等說辭 (因為氧化或還原似乎只是一體兩面), 若只就其還原作用來看, 一般蛋白質中有-S-S-鍵, 也有-SH基團
就您所說的, 這兩種還原劑不論濃度高低皆可進行還原作用, 所以它們會使反應向右，如此造成的結果是：
1. 已存在的-SH可以保留, 因為氧化劑會"優先氧化"DTT, 因而使氧化劑失效, 達到保護作用;
2. -S-S-可以進行還原, 變成-SH而斷裂
所以新的問題產生了:
1. sample中的氧化劑如何決定優先順序?怎麼會傾向僅氧化DTT而不氧化sample?是因為人海戰術嗎?
2. 氧化劑氧化DTT 與 DTT打斷雙硫鍵的反應 一般來說誰較dominant?照您的解釋似乎 氧化劑氧化DTT的反應 佔主要角色, 等DTT濃度夠多, 尚有剩餘的DTT才有能力打斷雙硫鍵....我有誤解您的意思嗎?
3. 蛋白質denature是否有分程度上的差異?我看了很多Western sample處理的原理, 其中 加SDS-->加DTT-->加熱煮 的步驟中, 在Western中都是要denature protein, 它們每步都是必要的嗎? 因為我想說如果加入的還原劑夠濃, 足以打斷雙硫鍵, 是否就可以不需要加熱的步驟了?或是加熱夠久就不需要加DTT了?
抱歉問了這麼多問題...不過你的答案是我目前看到最專業的回答,真是感謝你了....!
回 答 者： onion ( 初學者 5 級 )
回答時間： 2006-05-08 11:35:39
既然你知道要加熱，而且也知道步驟目的是要使protein denature，那就很簡單了。DTT等還原劑只是把雙硫鍵打開(還原)，使加熱可以進一步破壞蛋白質的構型，如果不把雙硫鍵打開，加熱之後回溫蛋白質還是有機會恢復原狀，同樣的，光是把雙硫鍵打開也並不能完全破壞蛋白質既有的摺疊(folding)。
至於DTT作為保護劑(抗氧化劑)的濃度，跟作為還原劑的濃度天差地遠，另外一個網友的回應已經講的很清楚，不可混為一談。
2006-05-08 21:53:05 發問補充
恩...我综合了兩位的意見, 加上我自己一些認知, 整理如下:
在一般sample中, 由於空氣中的氧及細胞破裂因而產生許多破壞性氧化劑; 對策如下:
a. 加入低濃度DTT後, 這些氧化劑並沒有特別僅與DTT作用 或優先順序的問題, 只是加入DTT至少可以減少sample蛋白被氧化的機率; 而此低濃度之DTT也並非完全沒作用於雙硫鍵, 只是此種濃度之DTT無法達到明顯的效果
b. 若給予高濃度DTT, 則幾乎所有物質皆會被還原(不論sample或氧化劑), 因此既可以保護sample, 也可以打開蛋白質之雙硫鍵, 請問這樣對嗎?抱歉一再麻煩各位....
另外有一個小問題...僅靠加熱無法打斷雙硫鍵嗎? 因為onion網友的回答似乎表示加熱無法打斷雙硫鍵, 所以才要加高濃度的還原劑來幫忙, 不知道我有無誤解?
2006-05-09 22:38 回答補充
是的，你的想法沒有錯，或許我應該更精確的跟您說明，這樣您應該會比較清楚。
一般在lysis buffer中，用以保護free SH的DTT用量為1 mM，但是在1X SDS loading buffer用來denature protein的DTT用量為100 mM，兩者濃度上相差100倍。(也有人在SDS loading buffer中用更高濃度的...) 所以說兩者反應濃度差異相當大。
基本上在SDS loading buffer中是使用過量的DTT，可將絕大多數物質進行還原，但是畢竟有反應平衡，所以並非百分之一百全部還原，不過剩餘未還原之量不多。
關於denature protein的部分：
蛋白質的摺疊 (folding)是相當複雜的，牽涉到氫鍵 (hydrogen bond)、親水親油性結合 (hydrophobic-hydrophilic interaction)、電性結合 (electrostatic interaction)以及凡得瓦力(van der Waals force)等...
而利用還原劑來denature protein主要是用來破壞共價鍵的部分(disulfate bond)，至於要完整破壞蛋白質結構就是利用SDS以及加熱的共同作用。
SDS是一種detergen, 可用來破壞hydrophobic-hydrpphilic interaction，加熱則是提供熱量使hydrogen bond或van der Waals force不穩定 (熱力學原理)，所以在這些物質的共同作用下，可以讓蛋白質denature完整。(這邊僅為簡單描述，細節在此不多提)
SDS loading buffer成分：摘自Molecular cloning
100 mM DTT
2 % SDS
50 mM Tris
10 % glycerol
0.1 % Bromophenol blue
字數太多了，只好分成好幾次補充...
最後補充一點：
可逆化學反應的反應趨向並不是所謂優先順序的，而是反應強弱與趨向，這與反應平衡常數 (以酵素動力學來看可說是結合常數)有關，也與反應物的濃度有很大的關聯性，也不容易出現全有全無的反應 (所以才會被稱為可逆反應平衡)。
環境中的氧化劑較容易與DTT這樣的還原劑進行反應，一旦與DTT達反應平衡，對於蛋白質的free SH的氧化效果才較明顯；高量的DTT也會與環境中的氧化劑進行反應，達反應平衡後，對於protein的disulfate bond的還原才較顯著。
前面因為擔心不容易懂，所以用比較簡單的講法，如果有不完整之處還請您見諒。
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